В данной статье представлены обобщённые сведения, касающиеся распространения вируса, который при инфицировании вызывает заболевание, носящее название лихорадки Западного Нила. В тексте статьи приведено краткое описание ареала, в котором происходит распространение вируса во всём мире и, в частности, – на территории Российской Федерации. Обзорно показаны методы выявления генотипа данного вируса в пробах различного биологического материала.
Методы выявления генотипа вируса лихорадки Западного Нила в пробах биологического материала.
Лихорадка Западного Нила (ЛЗН) – природноочаговая летне-осенняя арбовирусная инфекция, которая протекает у человека в виде острого лихорадочного заболевания с симптомами общей интоксикации, головными и мышечными болями, часто с развитием менингита и менингоэнцефалита [1].
Вирус Западного Нила (ВЗН, West Nile virus) принадлежит к семейству Flaviviridae, роду Flavivirus, антигенному комплексу вирусов японского энцефалита (Japanese encephalitis virus group). По принятой в Российской Федерации классификации патогенных биологических агентов ВЗН относят к вирусам II группы патогенности. ВЗН является возбудителем природно-очаговой арбовирусной инфекции с трансмиссивным механизмом передачи, называемой лихорадкой Западного Нила (ЛЗН). Клинические проявления ЛЗН варьируют от гриппоподобного синдрома до развития тяжелых осложнений в форме менингита и менингоэнцефалита. Летальность при ЛЗН, в зависимости от иммунного статуса заболевших, составляет от 4 до 10 % [2].
Результаты клинико-морфологического анализа показали, что заболевание ЛЗН протекает преимущественно в гриппоподобной форме (66,7 %), а также в более тяжелой менингеальной форме (33,3 %). Срок инкубационного периода варьирует от 3 до 17 дней. Заболевание сопровождается снижением иммунитета и распространенными васкулитами во всех органах и системах, в результате возникают множественные очаги повреждения (дистрофии и некрозы). Клинически это проявляется в виде геморрагической сыпи, конъюктивита, лимфаденопатии, увеличении печени и селезенки, также могут наблюдаться явления миокардита, гепатита, гломерулонефрита, пневмонии [3].
В России болезнь впервые была зарегистрирована в 1997 г., первая крупная вспышка произошла в 1999 г., когда заболели более 400 человек. Случаи были зарегистрированы на территории Волгоградской области и Краснодарского края. За 15 лет инфекция распространилась по всему югу страны [4].
Ареалы ВЗН занимают огромные территории в пределах экваториального, тропического и умеренного климатических поясов в Африке, Европе, Америке, Азии и Австралии. В России ареал распространения ВЗН охватывает территории юга европейской части, регионы Сибири и Дальнего Востока [2].
В 2019 г. отмечено снижение заболеваемости (463 случая): в странах ЕС – 410 случаев заражения, на территории граничащих с ними государств – 53 случая, также было зарегистрировано 50 случаев смерти. Летальность составила 11 По опубликованным данным, на всей территории Южной, Восточной и Центральной Европы циркулируют 1 и 2 генотипы вируса Западного Нила (ВЗН) с доминированием 2 генотипа [5].
Проявления лихорадки Западного Нила в 2019 году в целом по России как и в 2018г. характеризовались эпидемическим подъемом заболеваемости. За сезон было зарегистрировано 352 лабораторно подтвержденных случая ЛЗН (0,2 на 100 тыс. человек), что в 2 раза превышает среднемноголетний показатель (2012–2018 гг., 0,1 на 100 тыс.) и в 4 раза показатель 2018 года. Случаи заболевания были выявлены в 14 субъектах 5 федеральных округов [5].
По современным данным штаммы ВЗН разделены на 9 генотипов (генетических линий). В России достоверно зарегистрирована циркуляция 1, 2 и 4 генотипов ВЗН, имеющих разное эпидемическое значение. Так, штаммы ВЗН генотипов 1 и 2 являются высокопатогенными для человека, а патогенность ВЗН 4 генотипа для млекопитающих пока не установлена. Имеются данные, что инфицирование некоторыми штаммами ВЗН субгенотипа 1а, приводит к появлению более тяжелых нейроинвазивных форм ЛЗН. Это, по-видимому, свидетельствует о более высокой вирулентности некоторых штаммов ВЗН субгенотипа 1а по сравнению со штаммами субгенотипа 1b и генотипа [2].
Одним из перспективных подходов выявления генотипа ВЗН в пробах биологического материала с высокой чувствительностью и специфичностью является использование полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией в реальном времени (ОТПЦР). ОТ-ПЦР является прямым методом выявления РНК ВЗН. В основе метода ОТПЦР лежит последовательное осуществление двух процессов: реакции обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции. Реакция обратной транскрипции представляет собой синтез цепи комплементарной ДНК (кДНК) по матрице РНК посредством фермента ревертазы. Метод ПНР заключается в амплификации целевых участков полученной кДНК посредством фермента ДНК-полимеразы и праймеров, фланкирующих участки уникальных кДНК-мишеней, существующих только у определенных генотипов вируса [2].
При детекции продуктов амплификации использование специальных флуоресцентных меток позволяет отказаться от стадии электрофореза, что не только сокращает время проведения анализа, но и снижает риск контаминации продуктами ПЦР и, соответственно, нивелирует ложноположительные результаты. Поскольку регистрация результатов проводится непосредственно в процессе реакции амплификации, весь анализ можно проводить в двух зонах лаборатории силами одного сотрудника. Этот подход позволяет проводить автоматическую интерпретацию полученных результатов и снимает проблему субъективной оценки электрофореграмм [2].
Известен способ обнаружения вируса лихорадки Западного Нила, предусматривающий проведение реакции обратной транскрипции с РНК вируса и последующей двойной амплификацией, а также набор олигонуклеотидных праймеров и зондов для идентификации вируса клещевого энцефалита, вируса лихорадки Западного Нила, боррелий и риккетсий методом мультиплексной ПЦР в режиме реального времени [2].
Технология [6] для секвенирования, в которой используются относительно короткие прочтения (например, содержащие менее чем 300 или менее чем 200 оснований, например, ~30-50 оснований) для достижения длинной непрерывной последовательности высокого качества, сравнимой или улучшенной по сравнению со стандартными технологиями. В наборе одна часть праймеров видоспецифична (вирус клещевого энцефалита, вирус лихорадки Западного Нила), а другая – родоспецифична (риккетсии и боррелии) [6].
Эта технология не ограничивается какими-либо конкретными платформами для секвенирования и является общеприменимой и не зависит от платформы. Например, помимо снижения времени выполнения на системах Illumina, сходное уменьшение времени наблюдается при получении последовательностей с использованием, например, систем Ion Torrent, Life Technologies, и GeneReader, Qiagen [7]. Однако предложенные в данных патентах олигонуклеотиды не позволяют определять генотип ВЗН [2].